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Intervista al dottor Vasco Meneghini

Le ricerche in campo di beta-talassemia ed anemia falciforme

Nel nostro viaggio tra i ricercatori italiani, ci siamo imbattuti in questo lavoro → pubmed.ncbi.nlm.nih.gov. Vasco Meneghini (Vasco Meneghini – HSR Research) che è incaricato presso il San Raffaele di Milano come Project leader – leggiamo – rispetto al “Gene and neural stem cell therapy for LSD Unit”, è uno degli autori di una pubblicazione scientifica che dimostra, peraltro, che “la delezione delle regioni di 3.5-kb e 7.2-kb produce un modesto aumento della globina fetale, probabilmente a causa di meccanismi molecolari che diminuiscono la formazione della proteina in presenza della beta-globina adulta”. E si è arrivati anche allo sviluppo di terapie sperimentali. Questo, invece, è l’introduzione dell’abstract del lavoro da cui si è partiti: “Naturalmente, ampie delezioni nel locus della β-globina provocano la persistenza ereditaria dell’emoglobina fetale, una condizione che mitiga la gravità clinica dell’anemia falciforme (SCD) e della β-talassemia”.

Come nasce il vostro studio?

Nella beta-talassemia, mutazioni nel gene della beta-globina riducono l’espressione della globina adulta (formata da 2 monomeri di beta-globina e 2 monomeri di alfa-globina) causando la formazione di agglomerati di alfa-globina responsabili dell’apoptosi dei precursori eritroidi, a cui consegue un’eritropoiesi inefficace e l’assenza di globuli rossi nel sangue. Nell’anemia falciforme, una singola mutazione nel gene della beta-globina provoca la polimerizzazione della globina adulta e un cambiamento conformazionale dei globuli rossi, che acquisiscono una forma “a falce” e si aggregano formando degli ostacoli al normale flusso sanguigno e di conseguenza ischemia degli organi. Lo studio condotto nel laboratorio della Dr. Annarita Miccio (laboratorio di Chromatin and gene regulation during development, Imagine Institute, Parigi) è nato dall’osservazione che la patologia nei pazienti affetti da beta-talassemia e anemia falciforme è meno severa in presenza di mutazioni in grado di riattivare l’espressione della emoglobina fetale (formata da 2 monomeri di gamma-globina e 2 monomeri di alfa-globina), normalmente espressa durante lo sviluppo embrionale. La persistenza ereditaria della globina fetale dopo la nascita permette di compensare l’assenza dell’espressione della globina adulta nei pazienti beta-talassemici e di mitigare la formazione di agglomerati di alfa-globina. Nei pazienti affetti da anemia falciforme, la gamma-globina è in grado di sostituirsi alla beta-globina mutata nella formazione dei tetrameri di emoglobina e di inibire i contatti molecolari responsabili della polimerizzazione della globina adulta.

Analizzando la regione contenente i geni delle globine (beta-globin locus) dei pazienti, abbiamo individuato delle regioni che risultano essere state delete nei soggetti che esprimono livelli terapeutici di globina fetale. In particolare abbiamo identificato: (i) una regione intergenica di 3.5-kb tra il gene della gamma e delta globina che contiene dei potenziali siti di legame per inibitori dell’espressione della gamma-globina; (ii) una regione di 7.2-kb che è la delezione più ridotta individuata in pazienti beta-talassemici con elevati livelli di gamma-globina; (iii) un’ampia regione di 13.6-kb che comprende la regione di 7.2-kb e si estende fino ad includere parte del gene della beta-globina, la cui delezione potrebbe essere responsabile sia della riattivazione della gamma-globina che del silenziamento della beta-globina mutata nei pazienti affetti da anemia falciforme.

Partendo da queste osservazioni, abbiamo deciso di riprodurre queste delezioni in modelli cellulari e cellule di paziente affetti da anemia falciforme tramite l’utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9, le forbici molecolari in grado di tagliare in modo mirato determinate sequenze del genoma umano. Questo approccio ci ha permesso sia di studiare l’interazione delle diverse regioni che regolano l’espressione della gamma-globina, sia dimostrare le potenzialità terapeutiche della riattivazione della globina fetale nel trattamento dell’anemia falciforme.

A quali conclusioni siete giunti?

Il nostro studio ha dimostrato che la delezione delle regioni di 3.5-kb e 7.2-kb produce un modesto aumento della globina fetale, probabilmente a causa di meccanismi molecolari che diminuiscono la formazione della proteina in presenza della beta-globina adulta. Al contrario la delezione della regione di 13.6-kb che provocava simultaneamente il silenziamento della beta-globina, ha prodotto un aumento significativo dell’espressione della gamma-globina sia nei modelli cellulari che nei pazienti affetti da anemia falciforme. Studi finalizzati a comprendere l’interazione tra le regioni regolatorie dei geni delle globine in presenza della delezione della regione di 3.6-kb hanno mostrato che l’attivazione della globina fetale potrebbe essere dovuta all’avvicinamento dei promotori delle gamma-globine ad una regione della beta-globina essenziale per aumentare i suoi livelli di espressione. E’ stato interessante notare che non solo la delezione di questa regione provoca un aumento della espressione della gamma-globina, ma anche la sua inversione. Dato che il semplice silenziamento della globina adulta non era sufficiente ad aumentare la gamma-globina a livelli terapeutici, abbiamo verificato che l’inversione della regione di 13.6-kb provocava un ri-arraggiamento del beta-globin locus con conseguente aumentata interazione dei promotori della gamma-globina con una regione responsabile di aumentare l’espressione delle globine (locus control region). Questi dati suggerivano che la delezione/inversione della regione di 13.6-kb poteva avere un risvolto terapeutico nel trattamento dell’anemia falciforme in quanto era in grado di inibire l’espressione della beta-globina mutata ed aumentare l’espressione della globina fetale nei globuli rossi.

Quali sono le terapie sperimentali su cui vi siete soffermati?

Il trattamento dei pazienti con trapianto autologo di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche geneticamente modificate per esprimere la beta-globina corretta nei globuli rossi è una terapia sperimentale che ha dato risultati promettenti sia nel trattamento di pazienti affetti da beta-talassemia (ad esempio lo studio TIGET-BTHAL presso l’Ospedale San Raffaele, supportato dalla Fondazione Telethon ed Orchard Therapeutics; PMID: 30664781) che da anemia falciforme (ad esempio lo studio HGB-205 presso Hôpital Universitaire Necker Enfants-Malades; PMID: 35075288).

Il nostro approccio è invece basato sull’attivazione della globina fetale tramite l’utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 nelle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche al fine di raggiungere simultaneamente un doppio effetto terapeutico nell’ambito dell’anemia falciforme, silenziare la beta-globina mutata ed indurre l’espressione della globina fetale nei globuli rossi.

Nel nostro studio abbiamo dimostrato in saggi su culture di cellule di paziente che la delezione della regione di 13.6-kb preveniva l’apparizione di due delle principali caratteristiche patologiche dell’anemia falciforme, la formazione di polimeri della beta-globina mutata ed il cambiamento conformazionale dei globuli rossi, evitando così la generazione di cellule con una forma “a falce”, responsabili delle occlusioni dei vasi sanguigni.

Quali differenze sostanziali rispetto alle terapie tradizionali?

“Le terapie tradizionali prevedono una regolare e ripetuta trasfusione sanguignea nei pazienti che può provocare effetti collaterali, quali accumulo di ferro e danni agli organi. La sola terapia definitiva è basata sul trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche da donatore immunocompatibile, che però è disponibile solo per una frazione di pazienti.

Il nostro lavoro e quello di altri colleghi stanno contribuendo allo sviluppo di nuovi medicinali di terapia avanzata per un trattamento a singola somministrazione potenzialmente disponibile per tutti i pazienti. Essi si basano sul prelievo delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche del paziente, la loro ingegnerizzazione per esprimere livelli terapeutici della proteina, e la conseguente re-infusione nel paziente stesso, evitando in tal modo problematiche relative alla reperibilità di donatori compatibili. Naturalmente, è essenziale verificare che le modifiche nel genoma non risultino essere potenzialmente pericolose provocando fenomeni di cancerogenesi, che attualmente non sono stati individuati nei di pazienti trattati con ATMPs basati su vettori lentivirali. I dati preclinici sono molto promettenti, ma solo recentemente sono stati trattati i primi pazienti con la tecnologia CRISPR/Cas9, di cui si sta valutando l’efficacia ed il profilo di sicurezza”.

Cosa si aspetta, in prospettiva, in termini di evoluzione scientifica in materia?

“Negli ultimi anni la tecnologia CRISPR/Cas9 è stata applicata anche per lo sviluppo di approcci di terapia genica per il trattamento di altre patologie. Presso l’Istituto San Raffaele Telethon per la terapia genica di Milano (SR-Tiget) stiamo attualmente sviluppando una terapia basata sull’utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 e di base editors (sistemi CRISPR/Cas9 modificati per convertire singole basi del DNA) per correggere le mutazioni che causano una malattia neurodegenerativa, la sindrome di Alexander. Questo progetto, denominato “ASTRO-EDITING” e finanziato dall’Unione Europea tramite la Marie Skłodowska-Curie Actions (Agreement n. 895111), potrebbe aiutarci a comprendere i meccanismi patologici e sviluppare una potenziale cura per questa malattia infantile estremamente rara. Il nostro lavoro è stato pionieristico nello studio dei meccanismi di riattivazione della globina fetale e nell’utilizzo dei sistemi di CRISPR/Cas9 come approccio terapeutico per il trattamento della anemia falciforme. Dalla pubblicazione del questo lavoro sono stati fatti notevoli passi in avanti in questo settore, sia da noi che da altri colleghi in Europa e negli Stati Uniti d’America. Sono stati individuati delle sequenze specifiche nei promotori delle gamma-globine la cui distruzione tramite sistemi CRISPR/Cas9 è in grado di inibire il legame di inibitori e riattivare l’emoglobina fetale (PMID: 32917636; PMID: 34418541; PMID: 31698466). Un simile approccio è basato sulla distruzione di regioni che regolano l’espressione degli inibitori nei globuli rossi, provocando in tal modo il loro silenziamento e la conseguente espressione della gamma globina (PMID: 30911135). Recentemente, è stato possibile anche correggere la mutazione responsabile dell’anemia falciforme, tramite un sistema basato su CRISPR/Cas9 che permette la sostituzione della sequenza mutata con un frammento di DNA esogeno che contiene quella corretta (PMID: 34135108). Alcuni di questi approcci sono attualmente in fase sperimentale clinica (PMID: 33283989) e hanno il vantaggio di modificare poche basi del DNA, ottenendo potenzialmente una maggiore efficacia ed un elevato profilo di sicurezza rispetto alla delezione di ampie regioni del genoma umano”.

Referenze:

PMID: 30664781: Marktel S et al. Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia. Nat Med. 2019 Feb;25(2):234-241.  doi: 10.1038/s41591-018-0301-6.

PMID: 35075288: Magrin E et al. Long-term outcomes of lentiviral gene therapy for the β-hemoglobinopathies: the HGB-205 trial. Nat Med. 2022 Jan;28(1):81-88.  doi: 10.1038/s41591-021-01650-w.

PMID: 32917636: Weber L et al. Editing a γ-globin repressor binding site restores fetal hemoglobin synthesis and corrects the sickle cell disease phenotype. Sci Adv. 2020 Feb 12;6(7):eaay9392.  doi: 10.1126/sciadv.aay9392.

PMID: 34418541: Ramadier S et al. Combination of lentiviral and genome editing technologies for the treatment of sickle cell disease. Mol Ther. 2022 Jan 5;30(1):145-163.  doi: 10.1016/j.ymthe.2021.08.019.

PMID: 31698466: Métais JY et al. Genome editing of HBG1 and HBG2 to induce fetal hemoglobin. Blood Adv. 2019 Nov 12;3(21):3379-3392.  doi: 10.1182/bloodadvances.2019000820.

PMID: 30911135: Wu et al. Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells. Nat Med. 2019 May;25(5):776-783.  doi: 10.1038/s41591-019-0401-y. 

PMID: 34135108: Lattanzi A et al. Development of β-globin gene correction in human hematopoietic stem cells as a potential durable treatment for sickle cell disease. Sci Transl Med. 2021 Jun 16;13(598):eabf2444.  doi: 10.1126/scitranslmed.abf2444.

PMID: 33283989: Frangoul H et al. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):252-260.  doi: 10.1056/NEJMoa2031054.

 

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