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Così il dottor Matteo Bertelli rilancia la ricerca attorno alle molecole naturali

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Perché le molecole naturali possono intervenire sui biofilm

Prosegue il nostro viaggio tra le eccellenze accademiche italiane che si sono distinte per le publicazioni relative all’importanza delle molecole naturali. Le professoresse Francesca Cappitelli e Federica Villa sono incaricate presso il Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente dell’Università degli Studi di Milano. In questa specifica circostanza, ci siamo basati sulle novità apportate da questo studio scientifico.  Che cos’è un biofilm? Come possono le molecole naturali contrastarne l’incidenza? Perché e come, infine, le molecole naturali dovrebbero essere sfruttate di più e meglio? Abbiamo deciso di procedere mediante un’intervista duplice, partendo dalla professoressa Cappitelli, per poi passare ad ascoltare le argomentazioni scientifiche della professoressa Villa.

Prof. Francesca Cappitelli

  • Che cosa sono i biofilm e perchè è difficile eradicarli?
  •  

È stato stimato che la stragrande maggioranza dei microrganismi viva sotto forma di biofilm, una complessa comunità microbica associata ad una superficie e inglobata in una matrice polimerica autoprodotta. Quando non in forma di biofilm la crescita microbica è detta planctonica. Per rendere più chiara la differenza potreste immaginare la crescita planctonica di un microrganismo come la vita di un eremita e la crescita in forma di biofilm la vita di un uomo in una metropoli affollata.

La maggior parte dei microrganismi non causa problemi all’uomo ma una piccola parte di essi può dar luogo ad infezioni croniche, fenomeni di parassitismo negli animali e nelle piante, biodeterioramento di beni storico-artistici o depositarsi sulle superfici per la lavorazione degli alimenti. E’ quindi chiaro che oltre ad un danno notevole per la salute i biofilm possono causare un ingente danno economico.

Il ciclo di formazione di un biofilm è diviso in tre fasi principali: la prima in cui le cellule microbiche si associano ad una superficie, la seconda in cui aumentano di numero (perchè si moltiplicano e reclutano altre cellule dell’ambiente) incrementano la quantità di matrice prodotta e la terza in cui le cellule si possono allontanare dal biofilm o come cellule singole o come pezzi del biofilm stesso.

La crescita come biofilm consente ai microrganismi di sviluppare strategie di sopravvivenza coordinate ed efficienti. È infatti noto che i microrganismi in forma di biofilm sono fino a 1.000 volte più resistenti agli agenti antimicrobici rispetto a quando crescono in forma planctonica. A spiegare questo fenomeni ci sono diversi comportamenti, ad esempio che la matrice polimerica extracellulare protegge le cellule del biofilm dalla penetrazione di composti chimici e che alcune cellule nel biofilm diventano molto resistenti (in inglese ‘persisters’).

  • Che ruolo svolgono le molecole naturali per evitare biofilm?
  •  

Per contrastare i biofilm è possibile utilizzare -come si è sempre fatto- biocidi. Ad ogni modo a tutti è ormai noto che i biocidi presentano rischi per la salute umana e animale, possono causare danni all’ambientale e sono spesso molecole poco biodegradabili. Di conseguenza recenti politiche nazionali ed europee sono state volte a ridurne l’uso e comunque orientarsi verso strategie alternative.

La necessità di strategie innovative per contrastare i biofilm ha portato a un rinnovato interesse per i modi in cui gli organismi si proteggono dalla colonizzazione microbica. Ad esempio, le piante, che vivono in ambienti spesso ricchi di nutrienti, sono continuamente esposte a un’ampia gamma di microrganismi potenzialmente dannosi che possono crescere sulle loro superfici. Alcuni composti naturali, che noi uomini utlizziamo ad alte concentrazioni con effetti antimicrobici, e quindi che portano alla morte dei microrganismi, in natura sono presenti a concentrazioni troppo basse per uccidere. In molti casi quindi la capacità di uccidere di composti presenti in natura è principalmente una proprietà di laboratorio, poiché la concentrazione di questi composti nell’ambiente è insufficiente per esercitare effetti letali. Considerando questo fatto, si capisce come le difese chimiche di molte piante possano funzionare tramite meccanismi più sofisticati di uccidere il microrganismo.

  • Voi, nei vostri studi, parlate di “nuovi modelli”, “nuovi messaggi” e di “meccanismi unici”. Ce li elenchereste e spieghereste nei dettagli?
  •  

Se la concentrazione di una molecola naturale non porta alla morte del microrganismo ma ha un effetto antibiofilm allora vuol dire che è stato influenzato il comportamento multicellulare o sociale del microrganismo ovvero come si comporta. I meccanismi su cui agiscono le sostanze naturali a concentrazione subletale sono ad esempio ridurre la capacità di adesione alle superfici dei microrganismi; interferire nella produzione dei polimeri extracellulari autoprodotti che sono quelli che tengono insieme (o vicine) le cellule microbiche; oppure favorire l’allontanamento dalle superfici. In pratica possono agire su tutte e tre le fasi del ciclo di formazione di un biofilm.

Noi pensiamo che la nostra ricerca si inserisca perfettamente nell’Agenda 2030 per lo Sviluppo Sostenibile, un programma d’azione mondiale per le persone, il pianeta e la prosperità sottoscritto nel 2015 dai governi dei Paesi membri dell’ONU. Infatti, la sostenibilità discende spesso dallo studio delle caratteristiche dei sistemi ecologici, come autoregolazione, resilienza e resistenza che insieme influiscono sulla stabilità dell’ecosistema stesso. Un risvolto molto concreto delle nostre ricerche è che se le sostanze naturali da noi impiegate non esercitano la loro azione uccidendo le cellule, non impongono una pressione selettiva e quindi non provocano lo sviluppo di resistenze che sono un enorme problema molto attuale nel caso degli antibiotici.

Inoltre, le nostre ricerche vanno incontro agli obiettivi del Green Deal europeo sottoscritto a fine 2019 che promuove l’uso efficiente delle risorse passando a un’economia pulita e circolare. 

Prof. Federica Villa

Infatti, si sente sempre più spesso parlare di economia circolare, soprattutto in un contesto di sostenibilità, in alternativa all’attuale modello economico lineare. Come si colloca esattamente la vostra ricerca nell’ambito dell’economia circolare?

La nostra ricerca rientra perfettamente nel concetto di economia circolare poiché siamo in grado di recuperare composti naturali bioattivi da scarti industriali, rispondendo così al desiderio di riuso, riciclo e recupero dei rifiuti che sta alla base della crescita sostenibile. In questo modo diamo il nostro contributo al superamento del modello di sviluppo lineare, basato invece sul consumo di energia e di risorse naturali, in cui i prodotti, al termine del loro ciclo di vita, diventano rifiuti.

Un ottimo esempio di ricerca nell’ambito dell’economia circolare è rappresentato dal progetto VOLAC, terminato a marzo 2021 e finanziato dalla Fondazione Cariplo, di cui siamo i coordinatori scientifici. Con questo progetto abbiamo riconvertito gli scarti dei frantoi in composti antibiofilm non tossici ed energia mediante processi biotecnologici in grado di ottimizzare l’utilizzo delle risorse.

Mi spiego meglio. L’olio d’oliva è fondamentale per l’economia di molti paesi del mediterraneo, e l’Italia occupa una posizione di prim’ordine nella produzione, esportazione e consumo di tale prodotto. Soddisfare la domanda mondiale, ottenendo allo stesso tempo un sistema di produzione sostenibile, è fondamentale per sostenere l’attività dei frantoi.

Infatti, il marcato carattere inquinante dei sottoprodotti dell’industria olearia, unitamente agli elevati costi da affrontare per il loro smaltimento in ottemperanza alle normative vigenti, penalizza fortemente questo settore.

Pertanto, c’è un crescente interesse verso sistemi alternativi di valorizzazione dei sottoprodotti del frantoio, anche in considerazione del fatto che tali scarti rappresentano una preziosa fonte di prodotti “nobili” e di energia.

L’obiettivo principale del progetto VOLAC è stato dunque valorizzare gli scarti prodotti dai frantoi trasformandoli in frazioni fenoliche bioattive capaci di inibire la formazione dei biofilm microbici senza esercitare un effetto biocida.

Tale idea si è basata su due considerazioni principali: i) gli scarti dell’industria olearia sono ricchi in fenoli; ii) alcuni composti fenolici, ampiamente studiati dal nostro gruppo di ricerca, prevengono lo sviluppo di biofilm pericolosi agendo da deterrenti non tossici, disarmando i microrganismi senza ucciderli.

È stato utilizzato il processo biotecnologico noto come “dark fermentation” integrato in un concetto di bioraffineria per la co-produzione di bioprodotti da applicare in agricoltura in sostituzione ai pesticidi (frazioni fenoliche con attività antibiofilm) ed energia (bioidrogeno), partendo dagli scarti dei frantoi.

È stato dunque possibile creare una tecnologia pesticide-free ed ecosostenibile per prevenire lo sviluppo di fitopatie (che sono biofilm), convertendo così rifiuti dell’industria olearia in prodotti ad elevato valore aggiunto, e chiudendo il ciclo delle risorse in ambito agronomico. La valorizzazione integrata dei sottoprodotti alimentari rappresenta uno smaltimento ‘intelligente’ di rifiuti ad alto impatto ambientale. 

Quali pensate che possano essere i futuri sviluppi attorno alle vostre ricerche?

C’è ancora molto da fare in questo ambito. Non abbiamo ancora esplorato l’effetto a dosi sub-letali di molto composti naturali, e non sempre ne conosciamo il meccanismo d’azione. Come funzionano esattamente queste molecole? Qual è il target molecolare di queste molecole? 

Finora abbiamo capito che questi composti a dosi non letali sono degli “informatori chimici”, cioè molecole che forniscono un avvertimento sui cambiamenti ambientali, consentendo ai microrganismi di prepararsi alle avversità mentre le condizioni sono ancora favorevoli. Insomma, queste molecole creano una sorta di inganno. Fanno credere ai microrganismi che vogliono formare biofilm di trovarsi in un’ambiente sfavorevole, spingendoli così ad allontanarsi per cercare condizioni di crescita più idonee.

Sappiamo anche che il target molecolare di alcune molecole antibiofilm è la proteina WrbA che è coinvolta nel mantenimento dei chinoni in uno stato completamente ridotto, come misura di protezione contro lo stress ossidativo. Possiamo ipotizzare che lo scaffold attivo delle molecole antibiofilm possa modulare negativamente l’attività ossidoreduttasi di WrbA portando ad un accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS) all’interno delle cellule, influenzando così la formazione del biofilm. Dati recenti hanno dimostrato la capacità dei ROS di modulare la formazione del biofilm.

Tuttavia, questo è solo l’inizio per comprendere la funzione di queste molecole ed utilizzarle al meglio. Occorre trovare fonti alternative per recuperare queste molecole bioattive. È infatti impensabile distruggere interi ecosistemi per reperire i composti di interesse. Proprio l’interazione con le biotecnologie rappresenta oggi il punto di svolta nella risoluzione dei problemi legati alla produzione delle sostanze naturali: 1) recuperare le molecole bioattive da rifiuti con processi microbici in grado di trasformare scarti in risorse, proprio come fatto nel progetto Cariplo VOLAC; 2) applicare le tecnologie ricombinanti, ovvero esprimere geni biosintetici di sostanze naturali in ospiti eterologhi in modo che i microorganismi trasformati possano produrre la molecola di interesse.

Grazie alle biotecnologie sarà dunque possibile recuperare più facilmente le sostanze bioattive, permettendo di superare i problemi di scarsa disponibilità che ne hanno finora limitato un utilizzo pratico. 

Ritenete che le molecole naturali, ad oggi, non vengano abbastanza sfruttate (se sì perché)?

La letteratura scientifica è ricca di esempi di sfruttamento delle molecole naturali. Tuttavia, i composti naturali sono quasi sempre stati selezionati principalmente per i loro effetti letali. Quello che ancora manca è il loro sfruttamento a dosi sub-letali.

Lavorando a concentrazioni subletali, potremmo esplorare diversi tipi di risposta mediati da stimoli e segnali che offrono meccanismi più eleganti delle semplici attività biocida, come quella di influenzare il comportamento multicellulare manipolando l’espressione di fenotipi specifici che rappresentano diverse fasi del processo del biofilm. Anche se le molecole naturali sono sempre state utilizzate per lo sviluppo di nuovi prodotti utilizzati in cosmetici, prodotti farmaceutici e integratori per la salute, ci sono ancora molte risorse che possono essere esplorate nella ricerca moderna. Il Dictionary of Natural Products ha registrato più di 300.000 composti naturali, tra cui circa 200.000 strutture uniche. Ad oggi i prodotti naturali derivati dalle piante rappresentano la più prolifica sorgente conosciuta di composti utili dal punto di vista industriale. È probabile che la stragrande maggioranza delle specie vegetali non siano state ancora sistematicamente studiate. Inoltre, il pieno potenziale dei composti bioattivi derivati da microrganismi è ancora largamente inutilizzato. Meno dell’1% di questo vasto patrimonio di biodiversità è stato studiato principalmente per la non coltivabilità dei microrganismi in laboratorio. Utilizzando le più recente tecniche di biologia molecolare saremo in grado di conoscere meglio struttura e attività delle comunità microbiche e potenzialmente beneficiare di una fonte illimitata di nuovi composti bioattivi.

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